Roteiro de aula prática 3:
Enzimas de restrição
1. Enzimas de
Restrição
Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a
eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da
célula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se
que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas
era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu
DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada
DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu
próprio DNA desta degradação “camuflando-o” através da metilação de algumas
bases específicas (modificação). Como consequência, este sistema é frequentemente
descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de
bactérias.
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição
são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos
sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes
na Tecnologia do DNA Recombinante, são proteínas monoméricas ou diméricas e
clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento
deste tipo de enzima é normalmente uma sequência palindrômica, isto é, ela
tem um eixo de simetria e a sequência de bases de uma fita é a mesma da fita
complementar, quando lida na direção oposta (Figura 1).
Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de
restrição. As setas indicam os sítios de clivagem e as linhas pontilhadas
representam o centro de simetria da sequência.
Estas enzimas reconhecem sequências específicas de 4 a
8 pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita.
Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de
simetria da sequência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os
cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando
extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas consequências estão
mostrados na Figura 1.
Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram
identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do
microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o
gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra
letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por
exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia
coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que
a Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.
A Tabela 1 mostra a sequência
palindrômica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrição. Note que
algumas enzimas deixam terminações coesivas enquanto que outras fazem cortes
abruptos ou não coesivos.
Tabela 1. Algumas endonucleases de restrição: origem e sítios de
clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se,
respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.
O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em
1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA
deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos
fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos
de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de
qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou
isolar proteínas de culturas bacterianas.
Uma importante consequência da especificidade destas
enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no
DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste
DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos
quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de
restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos
(44=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 pb clivam o DNA em
média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta média pode
sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de
bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8pb, incluindo
nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos.
A família de fragmentos gerados por digestão com
enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por
eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos
moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).
Figura 2. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser
separadas por eletroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que
moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com
brometo de etídio, uma molécula que fluoresce quando
iluminada com luz Ultra
Violeta.
Objetivo
Demonstrar como ocorre uma reação de restrição de DNA com a utilização
de enzimas de restrição.
Materiais e Métodos
Microtubos de 1,5 mL e 0,2 mL.
Galeria para microtubos.
Pipeta automática.
Ponteiras.
Reagentes: Enzimas de restrição,
tampão específico, e DNA.
Banho maria
Digestão total
1 - A um microtubo colocado no gelo
adicionar:
5μl do DNA amplificado por PCR
1μl de tampão conveniente (10x conc.)
Água ultra-pura esterilizada q.s.p. 1 μl.
Misturar suavemente agitando no vortex.
Manter o microtubo no gelo.
2 - Adicionar 1μl da enzima de restrição e
agitar.
As enzimas de restrição são extremamente
caras e de grande instabilidade.
Nas preparações comerciais, estas enzimas
estão em soluções concentradas de glicerol e mantidas a -20°C. Assim, deve-se
ter o maior cuidado ao pipetar estes produtos para evitar desperdícios e
desnaturações, de acordo com os seguintes conselhos:
Certificar-se que usa sempre uma ponta nova
da micropipeta;
Mergulhar o mínimo possível da ponta no
líquido para pipetar;
Manter a solução da enzima o mínimo de tempo
possível fora do recipiente refrigerador ou gelo;
Usar o mínimo possível de enzima, garantindo
que este volume não contribui com mais de 10% do volume final de reação.
Para calcular a quantidade a usar, consultar
a ficha técnica do fabricante. De um modo geral, 1 unidade corresponde à
quantidade de enzima necessária para digerir completamente 1μg de DNA do fago
lambda, durante 1 hora a 37°C e com o tampão adequado. Para efeitos práticos,
considera-se que:
1U digere 1μg DNA/hora
3 - Incubar a mistura à temperatura
conveniente de acordo com a enzima (normalmente 37°C) e durante mais ou menos 2 horas.
4 - Analisar os produtos da reação em
eletroforese com gel de agarose ou poliacrilamida.
