Roteiro de Aula Prática 3

Roteiro de aula prática 3:

 Enzimas de restrição

1. Enzimas de Restrição

Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu próprio DNA desta degradação “camuflando-o” através da metilação de algumas bases específicas (modificação). Como consequência, este sistema é frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de bactérias.

As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, são proteínas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma sequência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a sequência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta (Figura 1).

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.

Estas enzimas reconhecem sequências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas consequências estão mostrados na Figura 1.

Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que a Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

A Tabela 1 mostra a sequência palindrômica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrição. Note que algumas enzimas deixam terminações coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou não coesivos.

Tabela 1. Algumas endonucleases de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas.

Uma importante consequência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos (4⁴=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta média pode sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8pb, incluindo nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos.

A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Figura 2. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com brometo de etídio, uma molécula que fluoresce quando 

          iluminada com luz Ultra Violeta.

Objetivo

Demonstrar como ocorre uma reação de restrição de DNA com a utilização de enzimas de restrição.

Materiais e Métodos

Microtubos de 1,5 mL e 0,2 mL.

Galeria para microtubos.

Pipeta automática.

Ponteiras.

Reagentes: Enzimas de restrição, tampão específico, e DNA.

Banho maria

Digestão total

1 - A um microtubo colocado no gelo adicionar:

5μl do DNA amplificado por PCR

1μl de tampão conveniente (10x conc.)

Água ultra-pura esterilizada q.s.p. 1 μl.

Misturar suavemente agitando no vortex. Manter o microtubo no gelo.

2 - Adicionar 1μl da enzima de restrição e agitar.

As enzimas de restrição são extremamente caras e de grande instabilidade.

Nas preparações comerciais, estas enzimas estão em soluções concentradas de glicerol e mantidas a -20°C. Assim, deve-se ter o maior cuidado ao pipetar estes produtos para evitar desperdícios e desnaturações, de acordo com os seguintes conselhos:

Certificar-se que usa sempre uma ponta nova da micropipeta;

Mergulhar o mínimo possível da ponta no líquido para pipetar;

Manter a solução da enzima o mínimo de tempo possível fora do recipiente refrigerador ou gelo;

Usar o mínimo possível de enzima, garantindo que este volume não contribui com mais de 10% do volume final de reação.

Para calcular a quantidade a usar, consultar a ficha técnica do fabricante. De um modo geral, 1 unidade corresponde à quantidade de enzima necessária para digerir completamente 1μg de DNA do fago lambda, durante 1 hora a 37°C e com o tampão adequado. Para efeitos práticos, considera-se que:

1U digere 1μg DNA/hora

3 - Incubar a mistura à temperatura conveniente de acordo com a enzima (normalmente 37°C) e durante mais ou menos 2 horas.

4 - Analisar os produtos da reação em eletroforese com gel de agarose ou poliacrilamida.