Roteiro de Aula Prática 2

Roteiro de aula prática 2:

PCR (Reação de polimerase em cadeia)

PCR é a replicação sequencial do DNA in vitro. O produto do PCR pode ser utilizado para: clonagem de genes, seqüenciamento de genes, identificação de patologias (infecciosas ou genéticas), taxonomia, genotipagem (fingerprints) e na medicina forense. Os princípios básicos da técnica da PCR foram descritos por Kjell Kleppe, Har Gobind Khorana e colaboradores em 1971. Neste período o aparelho era projetado para acrescentar a enzima DNA polimerase a cada ciclo.

T. Brock e H. Freeze, em 1969, relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus –sobrevive na água à temperatura média de 75°C. Após esta descoberta, o DNA polimerase desta bactéria foi isolado e utilizado na PCR.

Esta técnica consiste de três etapas: Desnaturação, hibridização (pareamento) e polimerização (extensão). A desnaturação é a quebra das pontes de hidrogênio da molécula de DNA por aquecimento, este processo ocorre entre 94ºC a 96ºC. A segunda etapa é de pareamento, aonde o primer irá se ligar a sequência alvo, este processo ocorre na temperatura entre 37ºC a 65ºC. A última etapa é polimerização, que consiste na extensão da fita de DNA através dos iniciadores na temperatura de 72ºC.

Para que ocorra a amplificação do DNA é necessária a adição dos seguintes componentes: DNA polimerase, nucleotídeos (dNTP), primer (iniciador), tampão (manter o pH ótimo para a reação enzimática), MgCl₂ (co-fator enzimático) e DNA.

Objetivo da aula: Demonstrar aos alunos como realizar o preparo da mistura mestra (MIX) e a utilização do aparelho de reação de polimerase em cadeia.

Materiais e Métodos

- Microtubos de 1,5 mL e 0,2 mL.

- Galeria para microtubos.

- Micropipetador.

- Ponteiras.

- Reagentes: DNA polimerase, nucleotídeos (dNTP), primer, tampão, MgCl₂ e DNA.

- Fluxo laminar

- Termociclador

Procedimento para realização da técnica de PCR:

Preparação do Mix

2,5uL de tampão 10x

1,5uL MgCl₂  50mM

2,0 uL dNTP 10mM

0,5uL Taq DNA polymerase

1,0 uL Primer FF – 25mM

1,0 ulLPrimer RW – 25mM

13,5uL água de PCR

.

Reação final: 25uL (22uL  do Mix+ 3uL DNA)

Amplificação

94^°C / 2 min

40 ciclos de: 94^°C/30seg, 54^°C/ 1min, 72^°C/ 4min

72^°C/ 1min

4^°C (final) 

Corrida em Gel

       Gel a 1,5% em TBE 1x por 30 minutos, utilizando marcador de 100pb.

Resultado