Roteiro de aula prática 1:
Extração de DNA de Sangue Total
Extração de DNA de Sangue Total
O primeiro relato de isolamento
de DNA foi realizado por Friedrich Miescher em 1869. Ele isolou o DNA de
leucócitos presente em uma secreção purulenta.
A extração de DNA (cromossômico
ou plasmídio) e RNA é importante para a realização de técnicas de biologia
molecular, na área de saúde podem ser empregadas para o diagnóstico de doenças,
como as hereditárias ou infecciosas, além de ser empregadas na engenharia
genética como para produção de vacinas.
O material genético pode ser
obtido de diversos materiais biológicos tais como: sangue, soro, plasma,
líquidos corporais, tecidos e células, como também direto de agentes
infecciosos. Existem diversos tipos de protocolo para extração do material
genético, e este depende do material a ser extraído e para qual técnica será
utilizado (PCR, sequenciamento, clonagem e outros).
O processo de extração do
material genético consiste de três etapas: rompimento da membrana celular,
purificação do material genético (remoção dos restos celulares) e precipitação
do material genético. O rompimento do material genético é realizado com
detergentes (SDS ou CTAB), enzimas e algumas vezes, dependendo do material
biológico, aquecimento e agitação (vórtex e pérolas de vidro). Após o
rompimento da membrana celular, deve-se separar o material genético das
proteínas presentes nas células e proceder com a desnaturação das mesmas. Esta
fase pode ser realizada com substâncias como fenol, clorofórmio, enzimas
(proteinase K) e altas concentrações de sal. Após a separação e desnaturação
das proteínas, o material genético deve ser precipitado com álcool absoluto
(etanol ou isopropanol) e/ ou baixas temperaturas.
Um exemplo de protocolo de
extração de DNA de sangue total é a técnica de salting-out que utiliza concentrações de sal para realizar
separação do material genético e desnaturação de proteínas. Cerca de 500 uL do
sangue total é transferido para microtubos de 1,5 mL. Acrescenta-se 1 mL de
solução de RBCL (red blood cell lysis) ou tampão de lise I que é composta por
sacarose, triton, MgCL2 1M, Tris pH 7,5 1M e água ultrapura. Os microtubos são
agitados e centrifugados por 2 minutos a 8.000 rpm. O sobrenadante é descartado
e o processo é repetido até a clarificação do precipitado (sem vestígio de hemoglobina).
Após esta etapa é adicionados o tampão de lise II, 20uL de SDS (Sulfato dodecil
de sódio) e 240 uL de água ultrapura. Acrescenta 100 uL de solução saturada de
NaCL 6M, agita-se e depois centrifuga por 5 minutos a 10.000 rpm. O
sobrenadante é transferido para outro microtubo contendo 100 uL de NaCL
6M, centrifuga por mais 5 minutos a
5.000 rpm. O sobrenadante é transferido para outro microtubo e acrescenta-se 800uL de etanol absoluto
gelado. O tubo é invertido algumas vezes gentilmente e centrifugado por 2
minutos por 10.000 rpm. O sobrenadante é descartado e acrescido 500 uL de
etanol 70% e centrifugado por mais uma
vez por 2 minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante é descartado e o microtubo é
colocado para secar e depois o DNA é hidratado com 50uL de água ultrapura. O
DNA deve ser mantido a -20ºC.
Objetivo da aula: Mostrar aos alunos como realizar a extração de
DNA (através da extração de um vegetal), para que os mesmos tenham conhecimento
de cada etapa do processo e a finalidade da utilização dos reagentes.
Materiais e Métodos
Materiais necessários:
- Béquer
- Bastão de vidro
- Funil
- Faca de cozinha
- Filme plástico
- Detergente
- NACL
- Banho Maria
- Algodão ou papel viltro
- Material biológico (cebola,
morango, folha ou flor)
Procedimento para extração de DNA
1 – Preparo da solução de lise
(rompimento da membrana celular e desnaturação da proteína)
1.1 – Colocar 2/4 de água
destilada no béquer de 250 mL
1.2 – Acrescentar 2mL de detergente
1.3 – Acrescentar 2 g de NaCL
2 – Preparo do material vegetal
2.1 – Pique o material vegetal em
pequenos pedaços.
2.2 – Acrescentar este material a
solução de lise
2.3 – Misturar vagarosamente com
bastão de vidro e tampar com papel filme.
2.4- Incubar em banho Maria por
70ºC por 15 minutos.
2.5- Após incubação, filtrar o
material com auxílio de funil e papel filtro ou algodão.
3 – Precipitação do DNA
3.1 – Resfriar o material por 5
minutos em banho Maria com gelo ou no congelador.
3.2 – Retirar o material do
resfriamento e acrescentar o álcool absoluto gelado (colocar o equivalente do
filtrado).
3.3 – O DNA precipitado pode ser
visualizado no fundo da fase alcoólica como uma nuvem esbranquiçada.
Referência Bibliográfica:
- CARDOZO, D.M et al. Extração de DNA a partir de
sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos
leucocitários humanos e receptores semelhantes à imunoglobulina. 2009. Revista
da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, vol 42, n.6.
- LAHIRI, D. K. and NURNBERGER, J. Jr. A rapid
non-enzymatic method for preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies.
1991. Nucleic Acids Research, v. 19.
- RODRIGUES, C. D. N. et al. DNA
vegetal na sala de aula. 2008. Departamento de Botânica-IBUSP. São Paulo.
- ROSELINO, A. M. Biologia
Molecular aplicada às dermatoses tropicais. 2008. Anais Brasileiro de
dermatologia, v. 83, n. 3.
